高耐受性醋酸菌的选育及发酵工艺优化开题报告

一、文献综述

1.醋酸菌简介

醋酸菌属于变形菌门，α-变形菌纲，红螺菌目，醋酸菌科，绝大多数为好氧的革兰氏阴性，严格需氧菌，主要栖息在含糖，酸或乙醇的原料中；广泛存在于花卉，水果和果园的土壤中，醋酸菌最大的特征是在有氧条件下可以将乙醇氧化为乙酸^[1]

1.1醋酸菌的作用

醋酸菌在食醋酿造中起着核心作用，特别是在工业醋酸酿造中，菌种品质的优良与否直接决定着工业醋酸的品质及生产效率^[2]，同时也因为醋酸菌可以氧化葡萄糖和半乳糖酸等，对酿酒行业也有重要的作用。其次，醋酸菌可以被用于保健饮品红茶菌的发酵。并且在拉美地区醋酸菌还可以应用于可可的发酵中^[3]。除了在发酵食品中的应用以外，醋酸菌也被广泛应用与工业化学品的生物转化中。纤维素，D-塔格糖的生产中都应用到了醋酸菌。

1.2高耐受醋酸菌优点

在用醋酸菌发酵生产乙酸的过程中，初始乙醇的含量以及发酵的温度是影响发酵的两个关键因素。乙醇是醋酸发酵的底物，并且可以为醋酸菌的生长代谢提供能量，但是当乙醇含量超过4%vol时，醋酸菌的生长反而会受到抑制^[4]。另一方面，温度时影响醋酸菌生长和代谢的重要因素，也是醋酸菌氧化乙醇生成乙酸的必要条件。同时，温度过高会使醋酸菌发酵的基本酶类变性，也会导致细胞膜受损伤，导致细胞分散。所以，筛选出既具有耐高浓度乙醇，耐高温并具有高产酸特性的醋酸菌有利于醋酸菌发酵过程的优化^[5]。

2.醋酸菌的选育方法^[6]

2.1自然选育方法

自然选育法又称作自然分离，一般是通过多次传代或者长期保存，在自然环境条件或者压力下，对菌株进行分离培养，筛选，纯化从而获得相对优势的自发突变体。自然选育法选育周期长并且正向突变的几率很低，一般用于纯化和复壮菌株^[7]。虽然这种方法简便易行，但是醋培中的醋酸菌的自然突变率很低，往往筛选得到的菌种的性状远不及食醋酿造工业上常用的纯种ASI.41和沪酿1.01^[8]。

2.2物理诱变育种

物理诱变选育方法主要包括紫外诱变选育，微波诱变选育和低能离子注入。在这几种方法中最常用的一种就是紫外诱变选育。诱变育种选育醋酸菌具有操作简单，突变频率高，有利于筛选新的优良菌种等优点，但有益突变频率较低，变异的方向和性质难以控制^[8]。

2.3化学诱变选育

化学诱变选育一般是通过采用不同的化学诱变剂来实现的。化学诱变剂是一类能够与微生物的DNA起作用，并且可以导致其DNA发生变异的物质，包括烷化剂，天然碱基类似物，金属盐类，脱氨剂，移码诱变剂，羟化剂等^[9]。

2.4生物选育法

生物选育法主要是通过基因工程的手段定向对微生物进行改造的方法，目前国内外许多的国家已经将基因工程育种的方法运用到食醋的生产过程中，主要目的是为了获得高耐受性的醋酸菌。例如可以通过定向敲除目的基因以及采用聚合酶链式反应扩增乙醇脱氢酶基因片段从而改变醋酸菌的表达性状，从而选育出高耐受性醋酸菌。

3.醋酸菌耐酸机制简介

3.1细胞膜保护机制

Hananda等人在研究中发现磷脂酰乙醇胺氮甲基转移酶（PMT）可以使磷脂酰乙醇胺转化为磷脂酰胆碱。然而与正常表达PMT基因的菌株相比，PMT基因中断的突变菌株无法在细胞膜中正常产生磷脂酰胆碱，导致突变菌株的生长速率减小，最大菌体密度下降^[22]。因此可以推测细胞膜中的磷脂酰胆碱的含量与醋酸菌的耐酸性有关。

亓正良通过酸激复合紫外诱变筛选得到１株高产酸,高耐酸的突变菌株ＡpasteurianusCICIMB7003-02，该突变株在醋酸发酵过程中,细胞荚膜的分泌减少,细胞膜中不饱和脂肪酸的比例增加,细胞膜的流动性增加^[23]因此,细胞膜的结构和组成会影响醋酸菌的耐酸性。

3.2醋酸同化机制

Nakano发现顺乌头酸酶过表达的菌株的产酸量与耐酸性都优于原始菌株^[24]，顺乌头酸酶是在三羧酸循环中将柠檬酸转化为异柠檬酸的酶。三羧酸循环偶联有氧呼吸产能途径但在巴氏醋酸杆菌的TCA循环中由琥珀酰辅酶A到琥珀酸以及苹果酸到草酰乙酸的代谢通路的酶都不存在，所以巴氏醋酸杆菌要通过其他氨基酸回补途径运行并释放能量。胞内醋酸可以通过三羧酸循环途径被消耗，构建胞内完整且高效的三羧酸循环通路，会提高醋酸菌的耐酸性能。

3.3醋酸泵出机制

AatA是细胞膜上的ATP结合盒（ABC）转运体蛋白。该蛋白可以将细胞内的醋酸泵出。Nakano等人发现AatA基因中断的菌株在较高浓度的醋酸环境中，菌体生长速率下降，并且对醋酸的耐受性降低。进一步研究发现，携带有AatA的大肠杆菌转基因菌株对醋酸的耐受性得到了提高^[25]。所以，可以推测AatA基因与醋酸菌的耐受性有关。

3.4细胞对环境变化的适应机制

Okamoto-Kainuma发现当醋酸菌处于含乙醇，醋酸，高温的环境中时，细胞内将会产生多种分子伴侣蛋白。其中，GroES和GroEL含有热休克启动子同源序列，这两种蛋白质的表达都受到RpoH基因的控制，实验表明，RpoH基因中断的突变菌株对乙醇，温度，醋酸变化的耐受性比原始菌株的差，而过表达GroES的菌株的产酸量要比原始的菌株高^[26]。

4.醋酸菌的发酵工艺优化

通过研究醋酸发酵过程的代谢机制可以得知在发酵过程的关键酶，限制醋酸发酵的因素以及发酵所需的条件可以有目的的优化醋酸菌的发酵工艺

4.1醋酸菌发酵机制

食醋是糖质或淀粉质等原料经过淀粉糖化，生成葡萄糖经过酵母菌的酒精发酵，最后醋酸菌利用其强氧化作用在乙醇脱氢酶（ADH）的催化下将乙醇氧化为乙醛，再在乙酸脱氢酶（ALDH）的催化下将乙醛氧化为乙酸。所以要积累乙酸的关键就在于必须切断或者减弱丙酮酸的旁路代谢，例如减弱丙酮酸参与三羧酸循环而形成乙酰辅酶A，切断丙酮酸生成乳酸等途径。同时还要加强乙醇的形成和氧化并且减弱乙酸的氧化，及时除去代谢产物的反馈抑制^[10]。

4.2高耐受性醋酸菌的发酵机制

高耐受醋酸菌具有耐高温，耐高浓度乙醇以及高产酸和耐酸的能力。在高乙醇浓度下醋酸菌的乙醇脱氢酶（ADH）和乙酸脱氢酶(ALDH)依然能白痴较高的活性，从而保证了乙醇呼吸链的供能。同时可以有效的调节菌体内的碳代谢，脂代谢以及氨基酸代谢。并且合成细胞活性保护物质，调节自身细胞的膜脂肪酸的组成以维持细胞膜的流动性^[11]。另一方面，在发酵过程中ADH和ALDH的活性与醋酸菌的高耐受性也有很大的关系。在高乙醇浓度的条件下，ALDH的酶活力会明显高于ADH，所以ADH成为了高乙醇浓度条件下醋酸菌发酵过程中的限速酶。高乙醇浓度条件下，酶的活力越高，菌种转换的乙醇就越多，菌种的耐乙醇能力越强^[12]。研究表明，醋酸菌对高温的耐受性与它们的ADH和ALDH的酶活力呈正相关。乙酸的存在对ADH和ALDH的酶活力具有较强的抑制作用，而耐高乙醇浓度的醋酸菌同时具有耐高温与耐酸的特性，这两种特性均有利于提升乙醇的耐受性^[12]。

所以在发酵过程当中必须适当增加发酵液中的乙醇浓度^[10]，并且将发酵温度控制在醋酸菌的最适温度30℃，使醋酸菌菌体内的各种酶都处于最适温度内，提高产酸率。

5. 我国食醋工业现状

食用醋是中国传统的调味品之一，市场需求量较高，目前年产量约400万吨。从食用醋生产的现状看，生产品牌众多，地方名醋分布全国各地，集中度偏低， 竞争激烈；从产品的形式看，除传统工艺酿造粮食用醋外，醋类品种不断丰富， 应用范围从调味逐渐延伸至饮料、保健等领域；从食用醋的生产技术与工艺改进 方面看，机械化、自动化逐渐普及于食用醋行业。高酸度醋是指醋液中醋酸含量 不小于 90g/L 的酿造食用醋，颜色为棕色、白色或淡黄色，具有杀菌效果好、 保鲜时间长、成本较低等优势。我国酿造高酸度醋的工艺主要分为两种：第 一种是冷冻浓缩工艺，如四川保宁醋，该工艺是通过将低酸度醋重复冷冻捞去浮冰从而制得总酸含量为 100g/L 的醋，这种醋风味物质种类多、固形物含量高，但是缺点是工作量大、产量低、质量指标不稳定、生产成本高；第二种是液态深层发酵法，该工艺方法具有发酵周期短、占地面积小、生产效率高、机械化程度高等优点而被欧美国家的醋厂广泛使用。当前国内大部分醋厂的设备和技术水平不高，大部分醋厂只能生产酸度不超过60g/L 的低酸度醋，生产的食用醋达 不到国外的 140g/L-170g/L 的总酸度和质量，所以筛选出优良菌种和优化醋酸发酵工艺来提高酸度成为了国内食用醋生产亟待解决的问题。醋酸菌的耐酸机制十分复杂，目前对醋酸菌耐酸机制的认识并不透彻。已提出的醋酸菌耐酸机制包括细胞膜的保护机制、醋酸同化机制、醋酸泵出机制、细胞对环境变化的适应机制四个方面。寻找这些机制的联系和纽带、研究这些机制之间的协作关系、探索新的耐酸机制对全面阐明醋酸菌的耐酸机制具有重要的意义，有利于为高酸度醋生产的菌种选育方面提供借鉴和指导。

二、本课题要研究的问题

近年来，随着居民消费水平不断提高，人们对生活质量的要求也随之提高，市场对醋产品的品质和层次要求也越来越高。醋酸菌在食醋酿造过程中起到核心作用，特别是在工业醋酸酿造过程中，菌种品质的优良与否直接决定着工业醋酸的品质及生产效率。但是在发酵过程中醋酸菌不可避免的受到乙醇，乙酸以及高温等环境因素的胁迫，会严重影响其发酵速率，发酵效率以及产酸量，同时也会增加生产成本^[13]。高酸度醋是指总酸含量为9%~25%（质量分数）的酿造醋，具有杀菌效果好，保鲜时间长，成本较低等优势；但是高浓度醋的生产比普通发酵醋生产难度大得多，主要是因为乙醇和醋酸分别作为醋酸菌的碳源和代谢产物，浓度过高会对醋酸菌细胞有毒害作用，因此会影响醋酸菌的产酸量^[14-15]。处于高醇，高浓度酸的条件下会对醋酸菌生长及产酸重量有所影响，而高温条件下则会使醋酸菌的产酸速率急剧下降，甚至导致菌种死亡，给醋酸发酵工业带来极大损失。所以通过各种手段选育出具有良好耐受性（如：耐乙醇，耐酸及耐温能力）并且具有高产酸的能力的菌种，具有重要意义.例如醋酸菌是典型的嗜中温菌，温度在其生长过程中有着重要影响。醋酸菌的最适生长温度是30℃^[16]。所以，选育出耐高温特性的高耐受性醋酸菌可以有效降低工业生产中冷却水的成本，并且可以减少环境污染等问题 ^[17]。优良醋酸菌的选育及高醇，高酸，高温下的耐受性研究对醋酸发酵工艺优化尤其是醋酸液态深层发酵工业具有极大意义。

本课题拟结合醋酸菌的代谢途径准备采用基因工程方法构建出高耐受性菌种，并对该菌种的发酵特性和耐酸机制进行研究。

三、本课题拟采用的研究手段

研究手段：基因工程方法构建高耐受菌群

本课题准备采用基因工程定向的手段定向对醋酸菌进行改造以获得高耐受性醋酸菌。例如：王婧等人利用基因工程技术构建巴氏醋酸杆菌AC2005uvrA基因敲除菌株和重组表达菌株，经过实验说明了uvrA基因敲除菌株的产酸量比原始菌株低，说明uvrA基因表达量的提高有利于醋酸菌的生长和产酸量的提高^[18]。T.Bepputm从醋酸菌基因组中提取并克隆了对醋酸菌具有干扰作用的ADH,ALDH,柠檬酸合酶基因及hisG基因，并构建了载体质粒^[19]并结合基因工程技术将此质粒导入到具有一定耐酸能力的醋酸敏感性突变体中^[20]，通过过表达ALDH，醋酸的发酵速率有显著提高，耐酸性也提高。宋山等人通过聚合酶链式反应扩增乙醇脱氢酶基因片段，构建了乙醇脱氢酶过表达的基因工程菌株，该菌株的乙醇耐受性和平均产酸速率都优于原始的菌株^[21]。根据国内外研究人员的研究成果可以得知采用基因工程技术定向对醋酸菌的基因进行改造可以选育出高耐受性的醋酸菌菌种，从而对醋酸菌的发酵工艺流程进行优化。

具体研究方法：

1.进行菌种活化制备种子液，摇瓶发酵，将发酵液涂于含有乙醇的碳酸钙培养皿上，初筛选出透明圈大的单菌落，然后进行摇瓶发酵实验，测量在整个发酵进程中，不同时间点的产酸量和OD600值的变化，绘制产酸曲线，进行多次重复实验，筛选出产酸量最高的菌种，取对数生长期菌液进行菌种保藏，并对该菌种进行16srDNA鉴定，了解该菌种的特点及代谢途径等。

2.做醋酸杆菌的摇瓶发酵实验，提取在不同发酵时间点下该菌种的RNA，进行转录组测序，构建原核链特异性转录组文库，与该菌种参考基因组进行序列比对分析，进行基因表达水平分析，找到差异表达基因，结合醋酸菌的代谢途径，用基因工程的方法构建高耐受性菌种，并进行发酵产酸实验，与原始菌株的产酸速率和最大产酸量进行对比，在此基础上再进行营养盐配方优化，通过单一营养物质缺乏实验确定关键营养物质的种类与含量以提高发酵产酸量。

3.利用荧光蛋白标记病原菌，对其进行定位和示踪，实现细菌在体内的实时监测，研究病原菌入侵的动态过程。选取合适的质粒，用分子生物学技术PCR扩增红色荧光蛋白基因，将其与酶切质粒连接构建重组质粒，然后导入感受态细胞中进行阳性克隆验证并测序，扩增重组质粒并提取重组质粒，电转化进入醋酸杆菌中，进行发酵，使红色荧光蛋白得以大量表达。

4.对选育出的高耐受性菌种进行发酵特性和耐酸机制研究。

5.对发酵工艺条件进行优化，改变培养基配方、补料方式、供氧策略等，在中试发酵设备中进行醋酸杆菌发酵，使单位时间的产酸量达到最大值，提高生产效率。

6.以果酒为原料生产果醋，探究鉴别食用果醋中的风味物质，建立分析方法的理论基础，采用各种现代分析仪器分析整个发酵过程中风味物质的组成和含量变化的规律。